Project Description
您知道血中癌细胞现今可经科技检验而无所遁形?您知道癌症在影像学还没产生变化之前，循环肿瘤细胞已能预知此变化之来临?精准医疗时代来临之际，文中为您揭开循环肿瘤细胞的神秘面纱。
◎甚么是循环肿瘤细胞?
循环肿瘤细胞是一群脱离肿瘤组织进入周边血液 中的肿瘤细胞【图 1】，该细胞被认为是导致肿瘤远程转移发生的必要前提，其数量可能因为肿瘤本身的 变化或治疗的反应而改变，因此侦测其数量可协助评 估癌症预后、治疗成效及后续病程发展，临床医师藉此拟定更精确的治疗方案，又被称为液态切片 (Liquid biopsy)。是低侵入性采检，可以替代肿瘤切片作为癌 症预后指标，测定 7.5 毫升血液中循环肿瘤细胞的数量，并于二周给予报告。除了乳癌之外，循环肿瘤细 胞也可临床应用于转移性大肠直肠癌、肺癌及摄护腺癌等预后评估。
迄今为止，肿瘤的手术切除以及全身辅助性治疗 是早期乳癌的标准治疗。尽管成功的初次治疗能成功 降低乳癌相关的死亡率，但是早期乳癌经长期追踪仍约有 30% 会产生转移。这些肿瘤的复发，通常是由于未被药物或放射线所根治的微小癌细胞转移扩散，其中许多发生在辅助治疗完后数年。未检测到的微小转移可能导致乳癌的初次治疗失败，单个癌细胞可能在疾病过程中早期由原发性肿瘤脱落，在体内分散到全身，并作为未来转移性生长的前兆。不幸的是，通过标准影像方法无法检测肿瘤细胞从原发肿瘤扩散到远处部位;因此，找到可以有效检测系统性微小转移的新生物标志物是很重要的议题。为此检测骨髓中的播散性肿瘤细胞(Disseminated Tumor Cell，DTC) 和周边血中的循环肿瘤细胞 (Circulating Tumor Cell, CTC)已成为乳癌转译研究的重点。骨髓取样的缺点是属于侵入性的手术，也因此医界的研究着重在周边 血液中较易于取得的 CTC。CTC 可以被认为是微小转移的替代标志物，并且可以提供重要的预后和预测信息。
◎如何检测循环肿瘤细胞?
近年来，随着许多技术的发展，利用乳癌患者周 边血中检测 CTC 的能力越来越成熟。然而 CTC 在血液 中数量非常少，通常每 106 到 108 个单核细胞中只有 1 个，因此它们的分离方法在技术上是一个很大的挑 战。简单来说，CTC 在周边血中处于休眠状态，只有 一小部分产生会远处转移。CTC 的鉴定和表征需要高 度敏感和特异性。其判定的方法包括浓缩(分离)和 检测(鉴定)程序的基本组合。收集后，大量白血球 仍残留在 CTC 的混和液中，可以通过细胞计数策略或 利用于核酸的技术将它们与正常血液细胞区分开来。 再使用免疫细胞化学和分子测定方式区分是否为循环 肿瘤细胞。通常使用下列检测方法
1. 利用蛋白质技术的方法
在细胞计数技术中，免疫细胞化学检测使用单 株抗体，其与在循环的肿瘤细胞上表达但在周围正 常细胞不表现的标志物结合。CellSearch 系统它使用 上皮黏附蛋白 (EpCAM) 阳性细胞的半自动收集和通 过 CK8,18 和 19 的免疫荧光染色及 CD45 的阴性来 对 CTC 进行特征化检验。CellSearch 系统和许多其他 CTC 分析使用相同的鉴定方法 ;CK(阳性标记物)， CD45(阴性标记物)和核染料(4% 6- 二氨基 -2- 羟 基吲哚，或 DAPI)进行荧光染色。通过荧光显微镜 的多色图像分析，CTC 被定义为 CK+ /CD45- / DAPI + 细胞【图 2】。
2. 使用核酸技术的方法
利用反转录 – 聚合酶链反应法 PCR(RT-PCR)测 定活 CTC 所产生的特定 mRNA 的已成为免疫细胞化学 测定的最广泛使用的替代方法。为了检测乳腺癌中的 大多数 CTC，多标记方法使用几种癌症相关基因或上 皮标志物，CK19 是试验中最常用的 RNA 标志物之一 核酸的方法为 CTC 检测提供了最高的灵敏度。
◎循环肿瘤细胞的临床应用
CTCs 于转移性乳癌
转移性乳癌比早期乳癌更有机会侦测出 CTC， CellSearch 系统敏感度约 10%-25%，阳性发现定义为 7.5-22.5 c.c 血液中有 1 颗以上 CTC，另一反转录核酸 技术方法对 CTC 发现敏感度约 41%。利用 CellSearch 系统在转移性乳癌中发现有 5 颗以上 CTC 的机会约有 50%。但是须注意特异性方面，某些上皮细胞标记可 能暂时表现于正常或未分化的血液、骨髓细胞成份， 例如:MUC1 也会表现于骨髓造血细胞的前驱物。纵 使非常小心的利用检验方法分辨出上皮细胞或血液细 胞，但是约 1% 正常人利用 CellSearch 检验也会发现 CTC。血液中呈现 CTC 往往意味容易复发、转移及不 良预后，但也不是化验出有 CTC 将来就一定会步上复 发、疾病恶化甚至威胁生命结果;学者分析发现血液 中呈现 CTC 者有部分的人在经过 7-15 年追踪并无疾 病复发。此信息显示目前检验方法侦测出的 CTC，其 中部份细胞在长期后并无使病情恶化的能力。
过去为了解微小转移肿瘤细胞常藉由分析骨髓中 散播的肿瘤细胞，然而骨髓的取样无法如抽血般那 么方便取样及可行;现今对于 CTC 的侦测方法 ( 包 括分离、计数及特殊项目查验 ) 常使用 CellSearch 系 统或 RT-PCR 方法来测验。CTCs 可以在 40~80% 的 转移性乳腺癌患者周边血液中检测到。大部份有关CTCs 于转移性乳癌的临床结果，数据都是来自利用 CellSearch 系统检验平台，临床试验中证实每 7.5 毫 升血液中若测得 5 颗以上的 CTCs，则在转移性乳癌 中具有较差的预后。CellSearch 系检验平台后续对 乳癌患者系列的研究也使得美国药物食品管理局在 2004 年批准以 CellSearch 检验平台作为评估转移性 乳癌的预后及监测治疗效果。虽然上述结果非常引人 注目，但是确无充分证据告知我们对上述血中不同 CTC 数目者该如何修正治疗方法。后来 Liu，海斯等 人对两大转移性乳癌病人试验，同样证实了在治疗前 和治疗后追踪期间评估的 CTCs 的确可有效预测病患预后【图 3】。
过去为了解微小转移肿瘤细胞常藉由分析骨髓中 散播的肿瘤细胞，然而骨髓的取样无法如抽血般那 么方便取样及可行;现今对于 CTC 的侦测方法 ( 包 括分离、计数及特殊项目查验 ) 常使用 CellSearch 系 统或 RT-PCR 方法来测验。CTCs 可以在 40~80% 的 转移性乳腺癌患者周边血液中检测到。大部份有关CTCs 于转移性乳癌的临床结果，数据都是来自利用 CellSearch 系统检验平台，临床试验中证实每 7.5 毫 升血液中若测得 5 颗以上的 CTCs，则在转移性乳癌 中具有较差的预后。CellSearch 系检验平台后续对 乳癌患者系列的研究也使得美国药物食品管理局在 2004 年批准以 CellSearch 检验平台作为评估转移性 乳癌的预后及监测治疗效果。虽然上述结果非常引人 注目，但是确无充分证据告知我们对上述血中不同 CTC 数目者该如何修正治疗方法。后来 Liu，海斯等 人对两大转移性乳癌病人试验，同样证实了在治疗前 和治疗后追踪期间评估的 CTCs 的确可有效预测病患预后【图 3】。
CTCs 对于 HER2 亚型或三阴性乳癌依 然有其预测准确性。此外血中 CTC 上升者较会有机 会在短期内疾病恶化，对于影像上无法或难以侦测评 估的转移病灶，可利用血中 CTC 作为客观评量方法。 CTC 数量变化与正子计算机影像显示病情变化结果吻合 度约 78%，结合正子计算机影像及 CTC 计量数可视为 非常具潜在能力于评估治疗反应，尤其适用于一般传 统影像学对病情难以评估的状况。与其需执行系列 X 光、骨骼扫描不如妥善应用病情、病史、理学检查、 肝机能测试、CEA、CA153 及 CTC 数目变化作为病 情变化评量方法。如果后项无辐射检测方法结果皆正 常那么在短期几个月内会从影像上发现病情恶化的机 会不高，那就可免除不方便又造价高昂的影像检查。 有大于 50% 的病人纵使已发生转移但却无法对转移 病灶作客观影像评量。截至目前 ASCO 对转移性乳癌 治疗准则尚未将 CTC 计量作为临床应用准则，然而 从 CTC 所累积的临床研究资料支持我们应用 CTC 计数检验值来互补肿瘤标记 CEA、CA153 在给予特定 治疗时参考值，同时提供协助是否需改变治疗剂量抑或终止治疗甚至应该重新进行影像评估以了解病情进 展或恶化。
CTCs 于早期乳癌
手术和辅助治疗后，肿瘤细胞的微小转移扩散可 能持续进展，治疗后持续对 CTCs 进行监测可以评估个 体的治疗功效，以及识别可能受益于其他治疗和 / 或 需要更密切监视的患者。研究报告指出在患有早期乳 腺癌的患者中约 20%至 30%的可于周边血液中检测 到 CTCs。
2012 年进行的一项对大约 3000 名早期乳腺癌 患者 CTCs 预后价值的分析显示，CTCs 的存在与较短 的生存率显著相关。近期来大型对 I~III 期乳腺癌患 者的研究，其中 20% 的患者被检测到 CTCs，与未侦 测到 CTCs 的患者相比，其呈现肿瘤较大，具较高的 组织学分级且有较多的淋巴结受到侵犯。CTC 的存在 是无疾病存活期和总存活期的独立预后因素。在德国 SUCCESS 临床试验中，证明 CTCs 可以作为辅助化疗 前后存活率的预后评估标志。其他研究也报导了早期 乳腺癌患者 CTCs 检测与生存率之间的关联性。
EpCAM 方法或 RT-PCR 方法可对早期乳癌提供临 床预后信息。于 2006 年就有文献发表利用 RT-PCR 化 验 167 位无淋巴转移的早期乳癌病人，经过化学、贺 尔蒙治疗并予临床追踪结果显示具 CK-19 mRNA 阳性 患者有较高的复发率及较差的存活率。此外很多研究 发现 CellSearch 系统检验法对于 I-III 期乳癌患者若是 7.5cc 血中含有 1 颗或 1 颗以上 CTC 者就容易早期复 发及较差的总存活率。不管用何种检验方法，有多篇 研究发现血中持续存在有 CTC 者预后较差。至于在术 前辅助性族群里，治疗反应达到病理完全缓解 (pCR) 与较佳的长期临床结果相关。术前辅助性化疗后 CTCs 的存在可能是治疗反应和生存率的替代指标。
综合结果指出对于早期乳癌，CTCs 能提供预后信息具临床确效性 (Clinical Validity)，但是如何作为有 效的临床应用 (Clinical Utility) 目前并不清楚。截至目 前为止，对于早期乳癌 ( 非转移性乳癌 ) 不管美国临床 肿瘤医学会 (ASCO) 或美国国家癌症中心网站 (NCCN) 治疗准则，并不建议利用计数循环肿瘤细胞来作为疾 病期数判别或辅助改变治疗决策。
◎ CTCs 在转移性乳癌中扮演 ” 液态切片 ” 的角色
肿瘤细胞特征表现可能在原发性进展到复发性乳 癌的过程中发生变化。已经有报告显示肿瘤细胞的基 因型及表现型在原发、次发及转移位置的型态皆有可 能不同。转移的肿瘤细胞可能随时间的变化改变基因 特征，特别是 CTCs 及转移肿瘤细胞的雌激素受体 (ER) 和 HER-2 的表现与原发肿瘤不一致。这些不一致性应 该要在转移处的肿瘤组织被确定，以作为复发、转移 后的用药选择，但是转移处进行组织切片生检具有侵 入性且可能存在技术上的困难，例如骨转移的组织生 检，而 CTCs 可作为一种低侵入性且实时 ” 液体活组织 检查 “。
◎结论和未来方向
许多对乳癌患者进行周边血液中 CTCs 评估的新技 术正在开发中，以便更全面地了解全身性微转移癌症。 CTCs 已经成为早期和转移性乳癌中强有力的预后指 标，可能有助于治疗策略的优化。此外探讨 CTCs 的生 物特性可进一步了解癌症转移的机制，研究 CTCs 的分 子特征能进一步得知肿瘤组织的基因组变化，预知可 能的抗药性以规划治疗方案。如何以 CTCs 检测辅助治 疗规划，有效避免癌症转移并降低死亡率仍是临床上 重要的课题。总体而言，CTCs 是乳癌转译研究中一个 令人兴奋的领域，可以作为新颖的生物标志，帮助了 解癌症转移，预测治疗反应及进行新药开发。
文 / 台北医学大学台北癌症中心副院长暨附设医院乳房医学中心主任 杜世兴
